Projeto usa proteína fluorescente para marcar bactérias

Liderado pelo pesquisador da Embrapa Agrobiologia (RJ) Stefan Schwab, um estudo avaliará inicialmente quatro estirpes de bactérias fixadoras de nitrogênio que serão monitoradas no interior da planta. A estratégia é utilizar engenharia genética de forma a marcar essas bactérias com uma proteína fluorescente verde (GFP, em inglês). Uma vez marcado, o microrganismo passa a ser mais facilmente identificado dentro da planta. "A intenção é complementar as tecnologias que já utilizamos de monitoramento de colonização das bactérias fixadoras de nitrogênio e de estímulo de crescimento vegetal em suas plantas hospedeiras", explica o pesquisador.

Por brilharem sob a luz ultravioleta, as proteínas fluorescentes são uma das mais importantes ferramentas para estudos em vários campos da biologia. Elas permitem a visualização de processos que não podem ser enxergados pelos cientistas, como o desenvolvimento de células, o alastramento de tumores, a progressão do mal de Alzheimer no cérebro ou mesmo o crescimento de bactérias.

A metodologia consiste em inserir na bactéria um gene que tem a capacidade de produzir essa proteína de fluorescência verde (GFP, em inglês). Apesar de não ser uma técnica nova, trata-se de algo bastante complexo. Segundo Stefan, a marcação da bactéria nem sempre funciona. "Existe uma certa especificidade entre as diversas versões do gene para essa proteína. Algumas versões funcionam para umas estirpes, mas não dão certo para outras. Precisamos testar várias versões em uma determinada estirpe até obter sucesso", explica.

Serão utilizados dois tipos de marcação por meio da GFP: ou a bactéria sempre vai apresentar a proteína, o que será utilizado apenas para saber se a bactéria está colonizando a planta; ou haverá uma situação de expressão induzida, em que se associa a proteína de fluorescência verde a um gene de interesse (no caso, envolvido com a fixação biológica de nitrogênio ou com a produção de fito-hormônio). Então, toda vez que a bactéria apresentar coloração verde é indicativo que ela está ativa, fixando nitrogênio ou produzindo fito-hormônio.

As estirpes utilizadas no estudo serão a BR3299 de Microvirga vignae, recomendada pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento para feijão-caupi; a BR11281 de Gluconacetobacter diazotrophicus, para cana-de-açúcar; a M24T3 de Serratia sp., que tem potencial para controle da doença-da-murchidão-do-pinheiro Pinus pinaster (pinheiro europeu); e os Bradyrizhobium spp., isolados recentemente pelos pesquisadores da Embrapa e que apresentam potencial para cana-de-açúcar.

No caso da estirpe BR3299 Microvirga vignae, recomendada para feijão-caupi, a intenção é conhecer um pouco mais a respeito de sua interação com a planta e, com isso, trazer mais informações sobre os mecanismos de colonização e sobre a competitividade dessa bactéria comparativamente a outras que estão naturalmente no solo e na planta.

Em relação aos Bradyrizhobium spp., o estudo está apoiando um outro projeto específico conduzido pelo pesquisador da Embrapa Luc Rouws para caracterização de rizóbios de cana-de-açúcar. A intenção é dar suporte, mostrando se a bactéria está colonizando a planta ou não.

Sobre a bactéria Serratia, o projeto busca atender uma parceria com a Universidade de Coimbra, em Portugal. Esse microrganismo apresenta atividade contra um nematoide que ataca o pinheiro europeu. A ideia é conhecer um pouco mais da sua propriedade de colonizar as plantas e exercer sua atividade nematicida (controle biológico contra nematoide), bem como verificar o potencial para ser inoculada no pinheiro.

Para a bactéria Gluconacetobacter, o objetivo é avaliar a fixação biológica de nitrogênio (FBN) e a produção de fito-hormônio quando associada à cana-de-açúcar. De acordo com Stefan, entre as bactérias que serão avaliadas esta é a mais conhecida, pois vem sendo alvo de vários estudos na Embrapa desde o fim da década de 1980. Por isso, a técnica da expressão induzida será utilizada apenas nela.

Stefan explica que a marcação da bactéria por si só nem sempre funciona. Por isso, só o fato de conseguir marcar pela primeira vez uma bactéria pode ser um excelente resultado. "A Microvirga, por exemplo, não a conhecemos muito bem e não existem procedimentos de modificação genética dessa bactéria. Então, tudo isso tem que ser estabelecido antes, para depois serem utilizadas essas ferramentas de engenharia genética", explica.

No caso dessas bactérias mais novas, especialmente as associativas e endofíticas, que não formam estruturas facilmente reconhecidas – como os nódulos nas leguminosas – e sobre as quais se conhece muito pouco a respeito da localização na planta, o pesquisador revela que é preciso procurá-las literalmente nos tecidos, o que é uma dificuldade a mais.

A coleção de bactérias fixadoras de nitrogênio e promotoras de crescimento da Embrapa Agrobiologia conta atualmente com aproximadamente 3.200 microrganismos. Para o pesquisador, esse procedimento de marcação e monitoramento de atividades benéficas tem potencial para ser aplicado em qualquer microrganismo da coleção. "Na verdade, teremos que adequar protocolos e tentar pegar uma rotina de análise para dar um passo além no conhecimento das bactérias que já são constituintes de inoculantes ou que venham a ser", revela.

Financiado pela Embrapa, o projeto "Uso de proteína de fluorescência verde para confirmar a colonização e a expressão de genes-chave em plantas hospedeiras por bactérias fixadoras de nitrogênio ou promotoras de crescimento" teve início no fim do ano passado e tem prazo de 24 meses.

Além de Stefan Schwab, fazem parte do projeto, como responsáveis por atividades ou colaboradores, os pesquisadores Luc Rouws, Márcia Vidal, Ivo Baldani, Jean Simões de Araújo, Kátia Teixeira, Gustavo Xavier, Jerri Zilli, Ederson Jesus, Elizabeth Correia, Veronica Reis e Segundo Urquiaga; os analistas Carolina Rossi, Patrícia Gitahy e Andreia Loviane; e o técnico Geraldo Baêta.

A descoberta e o desenvolvimento de proteínas fluorescentes coloridas revolucionaram a biologia na década de 1990 e renderam o Nobel de Química de 2008 ao japonês Osamu Shimomura e aos norte-americanos Martin Chalfie e Roger Tsien. De maneira independente, os três cientistas chegaram à proteína fluorescente verte (GFP, em inglês) obtida de uma água-viva bioluminescente que habita o norte do oceano Pacífico

As proteínas fluorescentes são hoje usadas por milhares de pesquisadores do mundo inteiro, inclusive no Brasil, para entender os diversos processos biológicos.