Pesquisa avança na inserção precisa de genes em culturas agrícolas

Pesquisadores da Universidade de Ciência e Tecnologia Rei Abdullah, na Arábia Saudita, desenvolveram um método para inserir grandes sequências genéticas em locais específicos do genoma vegetal. A técnica usa retrotransposons R2 e atua sobre regiões de DNA ribossômico. Os testes envolveram Nicotiana benthamiana e arroz, Oryza sativa (DOI 10.1038/s41587-026-03181-6).

A estratégia permite adicionar genes completos e elementos regulatórios com vários milhares de pares de bases. O sistema dispensa a formação simultânea de quebras nas duas fitas do DNA. Essa característica diferencia a abordagem de métodos baseados em nucleases, incluindo aplicações de CRISPR-Cas voltadas à inserção de genes.

A equipe adaptou retrotransposons R2 sem repetições terminais longas. Esses elementos usam RNA como molde e promovem transcrição reversa iniciada no alvo. A proteína R2 reconhece uma sequência conservada no DNA ribossômico, produz um corte em uma das fitas e inicia a síntese de DNA complementar a partir do RNA doador. O processo direciona a carga genética para loci específicos do DNA ribossômico.

Testes com proteínas

Os pesquisadores testaram proteínas R2 derivadas de Taeniopygia guttata, Zonotrichia albicollis e Bombyx mori. As variantes obtidas de Taeniopygia guttata apresentaram maior atividade em plantas. A equipe também ajustou sequências codificadoras, sinais de localização nuclear e a arquitetura do RNA doador para favorecer a expressão e a integração.

Em Nicotiana benthamiana, o sistema inseriu uma construção com proteína fluorescente verde de 2,2 quilobases no DNA ribossômico. A frequência de inserções intactas alcançou 75%. A análise molecular confirmou a integração nas regiões previstas e a expressão da construção genética. O número médio variou de 0,7 a 1,2 cópia por genoma nas amostras avaliadas.

O trabalho também instalou plataformas de recombinação com cerca de 0,6 quilobase. Essas sequências incluíram sítios compatíveis com os sistemas Bxb1, Cre e Flp. A frequência de inserções intactas chegou a 53%. As plataformas podem permitir a inclusão posterior de outras construções genéticas e apoiar o empilhamento de genes em um mesmo local genômico.

Vírus de RNA recombinantes

Os cientistas testaram ainda uma forma de entrega do RNA doador por vírus de RNA recombinantes. A proposta limita o período de disponibilidade do molde e reduz a presença de intermediários de DNA. O sistema manteve a integração dirigida no DNA ribossômico de Nicotiana benthamiana. A quantidade estimada variou de 1,97 a 4,06 cópias inseridas por genoma.

Análise em arroz

Em arroz, os pesquisadores introduziram construções de resistência à canamicina em calos. A variante R2-TG gerou mais de 17% de calos positivos. A versão otimizada R2-TGopt superou 12%. Os ensaios confirmaram as duas extremidades das inserções e a presença das construções nos loci de DNA ribossômico.

A equipe também integrou, em calos de arroz, uma versão sintética do gene da acetolactato sintase associada à resistência a herbicida. Brotações resistentes surgiram durante a seleção em cultura de tecidos. Contudo, as plântulas derivadas dos calos com inserção confirmada não se estabeleceram após a transferência para o solo.

O estudo não recuperou plantas regeneradas com inserções estáveis no DNA ribossômico. Em mais de 500 plantas de arroz da geração inicial, os pesquisadores não detectaram a integração obtida nos calos. Os resultados indicam possível instabilidade ou silenciamento da proteína R2 durante a regeneração. A atividade prolongada do sistema também pode afetar a viabilidade celular por alterações acumuladas nas regiões ribossômicas.

Análise em Nicotiana benthamiana

As análises em Nicotiana benthamiana identificaram inserções incompletas na extremidade 5' em 25% das leituras. Os demais 75% continham a sequência completa. O mapeamento não encontrou inserções fora do alvo nas amostras avaliadas, mas os pesquisadores recomendam estudos genômicos mais amplos e testes ao longo das gerações.

A técnica amplia as opções para introdução dirigida de genes longos em plantas. O método pode apoiar o desenvolvimento de características controladas por vários genes, rotas metabólicas sintéticas e plataformas vegetais para produção de moléculas de interesse. A aplicação agrícola ainda depende de maior controle temporal da atividade R2, aperfeiçoamento do RNA doador e recuperação de plantas férteis com inserções herdáveis.