Um trabalho inédito de pesquisa desenvolvido pela Embrapa conseguiu esclarecer os mecanismos moleculares que tornam algumas espécies de seringueira resistentes e outras suscetíveis ao mal-das-folhas. A doença, causada pelo fungo Paracercospora ulei (anteriormente identificado como Microcyclus ulei), é o pior problema enfrentado no cultivo de seringueira em regiões quentes e úmidas da América do Sul e representa um dos principais obstáculos para a heveicultura na Amazônia. A pesquisa é estratégica para o melhoramento genético dessa cultura e abre caminho para soluções tecnológicas que ofereçam ao setor produtivo de látex plantas mais produtivas e resistentes.
Das diversas espécies de seringueira (Hevea spp.), algumas vêm sendo utilizadas no programa de melhoramento genético de seringueira da Embrapa. A Hevea brasiliensis é conhecida como a mais produtiva em látex e as Hevea guianensis e Hevea pauciflora, embora menos produtivas, têm apresentado resistência ao mal-das-folhas. Buscando entender o que faz uma espécie resistente e outras não, foram analisados genes dessas três espécies de seringueiras e de um híbrido, comparados a fim de identificar quais genes e o nível de expressão deles na interação entre as plantas e patógeno (no caso, o fungo causador do mal das folhas).
“Pela primeira vez no mundo se entende, em nível molecular, alguns dos mecanismos que resultam em suscetibilidade ou resistência ao mal das folhas. E tivemos a chance de identificar vários genes responsáveis pelos mecanismos de resistência que são, há muitas décadas, descritos pelos fitopatologistas nos aspectos da fisiologia e da morfologia dos sintomas da doença, o que foi muito gratificante”, afirma a pesquisadora da Embrapa, Paula Angelo, que atua em biologia/genética molecular de plantas e cultura de tecidos
Os resultados da pesquisa estão descritos no artigo científico "Differential expression and structural polymorphism in rubber tree genes related to South American leaf blight resistance", publicado na revista Physiological and Molecular Plant Pathology.
O trabalho foi idealizado pela pesquisadora, quando atuava na Embrapa Amazônia Ocidental (AM), atualmente está na Embrapa Café (DF), e executado por uma equipe de pesquisadores da Embrapa que contou com Gilvan Silva, coordenador do Laboratório de Biologia Molecular da Embrapa Amazônia Ocidental, e Michel Yamagishi do Laboratório Multiusuário de Bioinformática da Embrapa Informática Agropecuária, sediado em Campinas, SP. Participaram do trabalho também o fitopatologista Luadir Gasparotto e o técnico Jeferson Chagas da Cruz, ambos da Embrapa Amazônia Ocidental.
A coleta de folhas dos clones de seringueiras foi feita em áreas de ocorrência do fungo em Manaus. Um dos desafios foi colher no estádio (etapa de desenvolvimento da planta) correto, e extrair RNA de boa qualidade, processo dificultado pelo látex, o que levou à necessidade de testar diferentes métodos, explica Angelo. A coleta e a extração de RNA dos materiais foram realizadas pelo Laboratório de Biologia Molecular da Embrapa Amazônia Ocidental.
O transcriptoma (conjunto completo de transcritos de RNA) de cada um dos clones de H. brasiliensis, H. pauciflora, H. guianensis e de um híbrido de H. guianensis x H. nítida foi sequenciado no Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho em Ciências da Vida (Lactad) da Unicamp, contratado para prestar os serviços de RNA-seq. Essa técnica de sequenciamento de última geração permite estimar a quantidade de RNA mensageiro (transcrito) produzido pelos genes ativos (genes expressos,que em conjunto geram o transcriptoma) no momento e condição em que as amostras são coletadas.
O Laboratório Multiusuário de Bioinformática da Embrapa Informática Agropecuária recebeu esses dados brutos, os reads (pequenos fragmentos de cópias do RNA das seringueiras). “Para se ter uma ideia do volume de dados, nesse projeto foram geradas 294 (duzentas e noventa e quatro) milhões de sequências”, conta Yamagishi, doutorado em matemática aplicada.
O pesquisador acrescenta que o passo seguinte foi montar o transcriptoma, algo similar ao encaixe de peças em um quebra-cabeça, com sobreposições dessas sequências até formar o transcrito. Esses transcritos são associados aos genes que estão sendo expressos naquela planta no momento da extração do RNA. Ele conta que a montagem desse transcriptoma exigiu uma metodologia específica, e em seguida, foram feitas duas análises diferentes, uma de expressão diferencial dos genes e outra de identificação de marcadores moleculares.
Na análise de expressão diferencial dos genes, Yamagishi explica que, a partir dos transcritos montados, é calculada uma medida que dá a ideia de quanto esse transcrito está sendo expresso naquela amostra. “Comparamos essas amostras entre si, e descobrimos 327 (trezentos e vinte e sete) genes ou transcritos que estavam diferencialmente expressos entre plantas resistentes e plantas suscetíveis”, informa.
A partir daí, foram selecionados 45 genes envolvidos diretamente na interação planta-patógeno. Os critérios dessa escolha foram baseados na investigação das rotas metabólicas em que os 327 transcritos diferencialmente expressos nas seringueiras estão incluídos e nas relações entre as rotas metabólicas das quais os 45 selecionados participam, afirma Angelo.
Os processos de preparação para a seleção dos 45 genes foram realizados utilizando programas que indicam a associação entre os que participam de processos metabólicos em comum e as interações entre os diferentes processos metabólicos nas células. Os bancos de dados consultados para descobrir as associações e interações entre os genes são alimentados com dados de espécies de plantas modelo, como Arabidopsis, que também foi utilizada para a anotação da identidade de parte dos genes do genoma de referência de H. brasiliensis, publicado em 2013. “Após essas análises, selecionamos os genes com maior potencial de envolvimento nos mecanismos de defesa que ocorrem em folhas de seringueiras expostas ao P. ulei, que causa o mal das folhas" explicou a pesquisadora.
Na segunda análise, foram encontrados dois tipos diferentes de marcadores moleculares, que são variações genômicas encontradas nos transcritos. “Identificamos 1.723 SNPs (Single Nucleotide Polymorphism, sigla em inglês, pronuncia-se snip), que são variações das sequências dos genes envolvendo um único nucleotídeo, além de 308 microssatélites, que são regiões repetitivas que variam em número de repetições. Se você somar esses dois números, totaliza 2.031 variações genômicas. A partir daí, nós pegamos esses 1.723 SNP e tentamos associá-los com o fenótipo de resistência e suscetibilidade. E descobrimos que a maioria desses SNP realmente diferem consistentemente entre plantas suscetíveis e resistentes”, afirma Yamagishi. "Essa última fase contou com curadoria humana, porque nem sempre os polimorfismos identificados automaticamente, que distinguiram o genoma de referência de H. brasiliensis das outras espécies/clones analisados ao longo da pesquisa, estavam associados com os fenótipos de resistência ou suscetibilidade", complementa Angelo.
“A identificação desses marcadores moleculares permite selecionar genótipos com maior potencial genômico de resistência ao mal das folhas”, constata Yamagishi. Essa informação pode ser aplicada no melhoramento genético para desenvolver plantas de seringueira resistentes à essa doença que afeta a heveicultura.
A pesquisadora Paula Angelo conta que a cianogênese é um dos exemplos de mecanismo já conhecido fisiologicamente que pode agora ser compreendido, pelo menos em parte, ao nível molecular. A produção de ácido cianídrico é uma reação de defesa da planta, pois é tóxico para muitos patógenos agentes causadores de doenças. Embora o ácido cianídrico produzido pela folha de seringueira seja importante na resistência a certos patógenos, diante do fungo P. ulei a reação é diferente.
Segundo a pesquisadora, há várias décadas estudos já indicavam que o fungo é bastante adaptado à presença do ácido cianídrico (HCN). E também já se sabia que há um paradoxo, pois a planta que produz mais ácido cianídrico (como defesa) não se torna a mais resistente. Ela explica que nesse estudo verificou-se que um dos genes que codifica a enzima linamarase envolvida na produção de ciano-aminoácidos (especialmente linamarina), está mais expresso nas folhas das espécies suscetíveis e que um dos genes de hidroxinitrilo-liases, enzima que participa da "quebra" dos ciano-aminoácidos para liberar o ácido cianídrico livre, está mais expresso nas espécies resistentes.
"Esses dados corroboram a informação registrada há décadas de que as espécies de Hevea suscetíveis têm bom potencial cianogênico (produzem muitos ciano-aminoácidos), mas são as espécies resistentes que têm boa capacidade cianogênica por conseguirem liberar o ácido cianídrico livre com maior rapidez ou quantidade”, afirma a pesquisadora, acrescentando que, a julgar pela expressão diferencial dos genes, as resistentes conseguem liberar cianídrico rapidamente apesar de não terem tanta reserva acumulada. As espécies suscetíveis não conseguem gerar ácido cianídrico livre com a mesma eficiência, apesar de acumularem quantidades muito maiores de precursores nas células, segundo a pesquisadora. O resultado dessas reações opostas que ocorrem internamente em nível molecular, também se manifesta externamente na planta.
Angelo cita que os resultados da pesquisa também permitiram determinar que os clones de seringueira suscetíveis superexpressam vias metabólicas responsivas ao ácido salicílico e ao ácido jasmônico simultaneamente, entrando em um ciclo autodestrutivo. Os clones resistentes exibiram vias de controle de estresse e responsivas ao ácido salicílico fortemente coordenadas.
Para a pesquisadora, isto acontece possivelmente “porque nas plantas suscetíveis, o reconhecimento da presença do fungo e o disparo das respostas ao ácido salicílico são mais lentas”. Com base nos estudos feitos, ela acredita que “devido a esse processo, a colonização das folhas pelo fungo progride mais amplamente, e as respostas estimuladas pelo ácido jasmônico também são ativadas, incluindo a produção de ácido cianídrico. Tudo isso gera muito estresse oxidativo, que age nas cadeias de transporte de elétrons, as folhas caem, especialmente quando há seca, e as plantas suscetíveis perdem produtividade, outros processos, como a fotossíntese e a renovação dos tecidos ficam dificultados”, explica.
Assim, os clones da Hevea brasiliense, embora sejam mais produtivos em látex, apresentam maior suscetibilidade quando estão sob ataques muito concentrados do fungo.
Clones de plantas resistentes, mesmo em áreas com a presença do fungo, conseguem produzir tecido novo e têm maior plasticidade para conviver com o fungo. Os clones de Hevea pauciflora e de Hevea guianensis demostram ser mais resistentes ao fungo porque além de conseguirem liberar cianídrico em quantidades suficientes e rapidamente, possuem também outros mecanismos de defesa, como um inibidor de poligalacturonase, e respostas de hipersensibilidade ativadas pelo ácido salicílico rápida e eficazmente.
A pesquisadora explica que com o melhoramento assistido por marcadores moleculares, pode-se obter clones de seringueiras com as características ideais de resistência e produtividade para cultivar seringueira no bioma amazônico, em menor tempo.
O chefe-geral da Embrapa Amazônia Ocidental, Everton Cordeiro, pesquisador que vem trabalhando no melhoramento de seringueiras nos últimos dez anos, destaca a importância da contribuição desse estudo de biologia molecular na definição e entendimento dos rumos da pesquisa com a seringueira no Amazonas. “Esse trabalho elucida do ponto de vista genético muitas das situações que foram desenvolvidas a partir do melhoramento convencional”, observa.
Cordeiro acrescenta que o estudo traz explicações moleculares para o sucesso obtido pelos cruzamentos feitos pelo pesquisador da Embrapa Vicente Moraes (já falecido) e que culminaram com o lançamento de materiais resistentes ao mal das folhas. “Essas explicações trazidas pela biologia molecular esclarecem como estamos conseguindo resistência ao mal das folhas para as nossas condições aqui. É um trabalho que tem muita importância para o cultivo da seringueira no Amazonas e no País”, afirma.
Cordeiro comenta que um dos clones analisados já era uma das apostas do Programa de Melhoramento da Seringueira conduzido na Embrapa Amazônia Ocidental para produção com resistência moderada. O clone foi identificado pelos fitopatologistas da Embrapa José Clério Rezende (já falecido) e Luadir Gasparotto a partir do fenótipo em campo. “O estudo mostrou que esse clone tem características moleculares iguais a dos clones das espécies resistentes ”, revela Angelo, relacionando que isso reforça o uso de ferramentas moleculares como aliadas na seleção de plantas para melhoramento genético.
O mal- das- folhas, causada pelo fungo Paracercospora ulei, é considerada a pior doença no cultivo de seringueira, pois reduz a produção de látex e pode levar as plantas à morte, gerando prejuízos na heveicultura.
A ocorrência do fungo do mal das folhas se estende pela América do Sul e representa um dos principais obstáculos para a implantação de cultivos de seringueira nas regiões quentes e úmidas, como a Amazônia. “O fungo ocorre desde o México até o norte do Paraná, no Brasil”, conclui Gasparotto.
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